單細(xì)胞和微量細(xì)胞甲基化測序技術(shù)是運(yùn)用線性擴(kuò)增技術(shù),對單個(gè)細(xì)胞基因組DNA的甲基化水平進(jìn)行單堿基精確檢測。分離單細(xì)胞后,將細(xì)胞用特殊的裂解液進(jìn)行裂解,并直接進(jìn)行重亞硫酸鹽處理進(jìn)行轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)換后的DNA作為模板,經(jīng)隨機(jī)引物擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測序,檢測全基因組的甲基化水平。
單細(xì)胞和微量細(xì)胞甲基化測序技術(shù)該技術(shù)可應(yīng)用于研究單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因組甲基化圖譜,對胚胎發(fā)育、腫瘤干細(xì)胞等微量或異質(zhì)性細(xì)胞的甲基化研究提供有力的研究策略。單細(xì)胞RRBS測序(scRRBS)是將單細(xì)胞分離后,通過單管酶反應(yīng),將細(xì)胞裂解后的基因組DNA連接接頭,特異性的檢測單個(gè)細(xì)胞的CpG島和啟動(dòng)子等區(qū)域的甲基化信息。該技術(shù)可運(yùn)用于胚胎發(fā)育、腫瘤干細(xì)胞等微量或異質(zhì)性細(xì)胞的甲基化研究。微量甲基化測序是指對5-10ng的基因組DNA或片段化的DNA,進(jìn)行全基因組甲基化檢測的技術(shù)。微量DNA樣本的甲基化測序技術(shù)可應(yīng)用于病灶組織、FFPE樣本和cell-free DNA甲基化檢測分析。
數(shù)據(jù)解讀分析內(nèi)容
- 基本數(shù)據(jù)處理:
- 原始數(shù)據(jù)評(píng)估,去除接頭與過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù);
- reads數(shù)量以及數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)。
- 基礎(chǔ)生物學(xué)信息分析:
- 將測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對,統(tǒng)計(jì)比對結(jié)果;
- 基于比對結(jié)果,統(tǒng)計(jì)各C位點(diǎn)的甲基化修飾信息;
- 測序數(shù)據(jù)的堿基覆蓋深度及覆蓋度統(tǒng)計(jì);
- 胞嘧啶(CG、CHG、CHH)甲基化水平統(tǒng)計(jì);
- 基因組甲基化分布及修飾特征分析;
- 高級(jí)生物學(xué)信息分析:
- 結(jié)合項(xiàng)目背景的差異甲基化修飾位點(diǎn)(DMS)的鑒定、注釋和分布分析;
- 結(jié)合項(xiàng)目背景的差異甲基化修飾區(qū)域(DMR)的鑒定、注釋和分布分析;
- 結(jié)合項(xiàng)目背景的差異甲基化修飾基因的功能、通路和疾病等富集分析;
- 結(jié)合項(xiàng)目背景,與其他多組學(xué)數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析。
樣本要求
- 細(xì)胞分離:由合作方完成單細(xì)胞分離;
- 樣品要求:單個(gè)細(xì)胞染色質(zhì)DNA量在0.5 pg-1 ng的范圍,單細(xì)胞樣本體積以不超過2μl;
- 單細(xì)胞送樣量:單細(xì)胞基因組擴(kuò)增,建議重復(fù)單細(xì)胞樣本個(gè)數(shù)不小于3個(gè);
- 微量樣本DNA送樣要求:單個(gè)樣本DNA量≥5ng,體積不超過30μl,無污染;
- 樣品寄送:*使用0.2mL平蓋PCR管收集樣品。用Parafilm封口膜纏繞封口,裝入PCR管盒,橡皮筋固定,再裝入自封袋,大體積干冰運(yùn)輸