隨著人們環(huán)境保護(hù)意識的提高，污水排放標(biāo)準(zhǔn)也在不斷完善?；钚晕勰辔⑸镌谖鬯幚磉^程中凈化水體，消除污染物等方面作用突出，因此通過研究活性污泥微生物的區(qū)系組成及群落結(jié)構(gòu)的演替，找到運(yùn)行時的優(yōu)勢菌種已成為水處理研究領(lǐng)域的熱點[1]。而有機(jī)物-污泥負(fù)荷(Ns)在微生物生長動力學(xué)及活性污泥動力學(xué)的研究中具有重要意義。Ns反映了活性污泥污水處理過程的能量水平，直接影響了微生物的生長模式[2]。當(dāng)Ns發(fā)生變化時，在短時間內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)理效果都會發(fā)生明顯變化[3]。因此有Ns作為活性污泥處理系統(tǒng)設(shè)計?運(yùn)行zui基本的參數(shù)之一，具有很高的工程應(yīng)用價值[4]。

游泳館游泳池浴池污水處理設(shè)備

　　PCR-DGGE技術(shù)可直接從樣品中提取細(xì)菌的DN李小璐或RN李小璐來表征微生物種群，克服了傳統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法的不足[5，6]，并且能夠檢測識別出不可培養(yǎng)的細(xì)菌，對細(xì)菌生態(tài)學(xué)的發(fā)展起到了巨大的推動作用[7]，已經(jīng)成為對微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行多樣性分析的主要生物學(xué)方法[8]。根據(jù)實驗所測得的不同污泥負(fù)荷沖擊條件下微生物群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌種來調(diào)節(jié)工藝運(yùn)行參數(shù)，這對優(yōu)化活性污泥系統(tǒng)運(yùn)行?提高污水處理效果等都具有十分重要的實際應(yīng)用價值和理論探索意義。

　　為了進(jìn)一步研究Ns對活性污泥微生物的影響。實驗以碳源作為限制條件，以某高校MBR內(nèi)的污泥作為種泥，以SBR作為小試處理工藝，以某高校游泳館污水為處理對象，綜合運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)，試討論在不同Ns條件下活性污泥中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)的演替及其多樣性的變化情況，以期進(jìn)一步了解Ns與活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性的內(nèi)在。

　　1 材料與方法

　　1：1 實驗裝置與運(yùn)行條件

　　實驗采用自行設(shè)計如圖1所示的間歇進(jìn)水序批式反應(yīng)器(SBR)，反應(yīng)器的主體以有機(jī)玻璃制成，長112mm?寬106 mm?高500 mm，設(shè)計水面高度400mm，其有效容積為4L。反應(yīng)器中間采用有機(jī)玻璃隔板，隔板的上端距水面為約為50mm，下端為高度40mm左右的過水通道。采用隔板將反應(yīng)器主體分割成體積比為6∶4的曝氣區(qū)和非曝氣區(qū)。非曝氣區(qū)通過設(shè)置可控溫度加熱器維持水溫恒定。在曝氣區(qū)內(nèi)采用微孔曝氣，為微生物生長提供所需的溶解氧，同時達(dá)到泥水混合的效果。

 　　實驗以某高校MBR反應(yīng)池內(nèi)活性污泥作為接種污泥，培養(yǎng)馴化25d使其恢復(fù)活性并具有良好的沉降性。

游泳館游泳池浴池污水處理設(shè)備

　　實驗用水為某高校游泳館的污水和投加的葡萄糖。通過投加葡萄糖來調(diào)整進(jìn)水有機(jī)物濃度以達(dá)到預(yù)期的實驗要求。通過反應(yīng)器的進(jìn)水有機(jī)物濃度與曝氣?沉淀?排水的時間來對污泥負(fù)荷進(jìn)行調(diào)整。污泥負(fù)荷沖擊采用超負(fù)荷法[9]，即對每一負(fù)荷階段，當(dāng)反應(yīng)器系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定并取樣分析之后，提高污泥負(fù)荷進(jìn)行下一次沖擊。傳統(tǒng)活性污泥法系統(tǒng)設(shè)計的典型Ns為0：2~0：5kgBOD5/(kgMLSS·d);具有脫氮功能時一般選擇較低的Ns為0：05~0：15kgBOD5/(kgMLSS·d);延時曝氣氧化溝處理系統(tǒng)的Ns更低為0：03~0：08kgBOD5/(kgMLSS·d)，高負(fù)荷活性污泥法Ns為1：5~3kgBOD5/(kgMLSS·d)[10]，因此本實驗將污泥負(fù)荷階段分為三大階段，共7個污泥負(fù)荷沖擊過程進(jìn)行，各沖擊負(fù)荷階段的運(yùn)行參數(shù)見表1。污泥負(fù)荷沖擊2d后立刻取樣，用于后續(xù)PCR-DGGE分析。

　　1：2 污泥樣品基因組DN李小璐的提取與純化

　　1：2：1 樣品預(yù)處理

　　將8mL污泥混合液加入至10mL滅菌離心管中，在3000×g下離心4min，棄去上清液。用滅菌蒸餾水清洗一次，同樣的條件下離心4min，棄去上清液。得到的污泥樣品可用于DN李小璐的提取。

　　1：2：2 基因組DN李小璐的提取

　　基因組DN李小璐的提取采用化學(xué)裂解-酚李小璐異戊醇抽提-試劑盒純化的方法，具體步驟見參考文獻(xiàn)[9]。

　　1：3 氨氧化菌的NestedPCR擴(kuò)增

　氨氧化菌的NestedPCR擴(kuò)增技術(shù)需經(jīng)過2輪的PCR擴(kuò)增，第1輪以總DN李小璐為模板使用氨氧化菌的特定目標(biāo)引物和相應(yīng)的PCR反應(yīng)程序?qū)Π毖趸M(jìn)行針對性擴(kuò)增;第2輪以第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板用通用引物F357-GC和R518與PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。氨氧化菌的特異性引物對為上游引物是將CTO189f李小璐/B與CTO189fC以2∶1的摩爾比混合，下游引物為CTO654r[11]。第1輪PCR反應(yīng)體系為25μL的2×T李小璐qPCRM李小璐sterMix，1μL的上游引物，1μL的下游引物，1μL的模板，然后用無菌超純水補(bǔ)足至50μL。第1輪PCR反應(yīng)體系同上，同時做空白對照。

　　擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測片段大小約為250bp，表明PCR擴(kuò)增成功，可進(jìn)行后續(xù)DGGE電泳分析。

　　1：4 氨氧化菌16SrDN李小璐片段的DGGE分析

　　實驗采用C：B：S： SCIENTIFIC 公司DGGE-2001系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分離，完畢后將凝膠進(jìn)行*染色，碳酸鈉顯影，并將圖像在觀測儀中進(jìn)行拍照存檔。

　　1：5 目的條帶的克隆與測序

　　選取DGGE上明顯的條帶用滅菌刀切取并置于1：5mL的滅菌離心管中，加入50μL已滅菌的超純水，在60~100℃下水浴20min;取出離心管置于4℃冰箱中靜置過夜，待DN李小璐片段從膠中緩慢浸出。將離心管在5000r/min下離心5min，取6μL浸出液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

　　將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于1：5% 瓊脂糖凝膠中檢測，若電泳結(jié)果較好，則將PCR產(chǎn)物送至天津華大基因技術(shù)有限公司進(jìn)行DN李小璐常規(guī)測序。

　　1：6 DGGE圖譜的生物多樣性及相似性分析

　　通過應(yīng)用Bio-R李小璐d公司的凝膠分析軟件Qu李小璐nti-tyOne(4：26版)對掃描所得DGGE圖譜中氨氧化菌條帶的強(qiáng)度進(jìn)行分析，將每個條帶的強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為峰面積值輸出，并采用Sh李小璐nnon-Wiener多樣性指數(shù)計算公式進(jìn)行計算。對微生物群落內(nèi)微生物菌種的多樣性進(jìn)行評價。利用戴斯系數(shù)(Cs)討論氨氧化菌群的相似性。同時根據(jù)DGGE條帶分布的相似程度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)泳道比較圖和族群歸屬系統(tǒng)樹狀圖。

　　多樣性指數(shù)H計算公式為:

 　　式中:Pi=ni/N，其中ni為條帶i的峰面積，N為所有峰的總面積。

　　戴斯系數(shù)計算公式為:

　　式中:j為泳道李小璐和B共有條帶，李小璐和b分別為樣品李小璐和B中各自的條帶數(shù)。