国产强伦姧在线观看无码,中文字幕99久久亚洲精品,国产精品乱码在线观看,色桃花亚洲天堂视频久久,日韩精品无码观看视频免费

      您現(xiàn)在的位置:智能制造網(wǎng)>技術(shù)中心>原位雜交實(shí)驗(yàn)要求及步驟

      直播推薦

      更多>

      企業(yè)動態(tài)

      更多>

      推薦展會

      更多>

      原位雜交實(shí)驗(yàn)要求及步驟

      2011年06月23日 10:06:08人氣:3634來源:上海玉博生物科技有限公司

       

      原位雜交組織或細(xì)胞化學(xué) (In situ Hybridization Histochemistry,ISHH) 簡稱原位雜交(In Situ Hybridization),屬于固相分子雜交的范疇,它是用標(biāo)記的DNARNA為探針,在原位檢測組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同,原位雜交可分為DNA-DNA雜交,DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測,原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交,雜交后分別通過放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應(yīng)直接顯示。間接法一般用半抗原標(biāo)記探針,zui后通過免疫組織化學(xué)法對半抗原定位,間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。原位雜交zui初是以同位素標(biāo)記探針進(jìn)行的。盡管同位素標(biāo)記35S,3H,32P仍然廣泛使用,但非同位素標(biāo)記探針的迅速發(fā)展尤其是生物素標(biāo)記探針和地高辛標(biāo)記探針,更引起科技工作者的極大興趣。
      一、基本要求
      組織取材:組織取材應(yīng)盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快,所以新鮮組織和培養(yǎng)細(xì)胞在30min內(nèi)固定。
      固定目的是:
      (1)保持細(xì)胞結(jié)構(gòu);
      (2)zui大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNARNA的水平;
      (3)使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。
      zui常用的固定劑是多聚甲醛,與其它醛類固定劑不同,多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接,因而不會影響探針穿透入細(xì)胞或組織。
      增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性:
      (1)稀酸處理和酸酐處理:為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結(jié)合,以降低背景,雜交前標(biāo)本可用0.25%乙酸酐處理10min,經(jīng)乙酸酐處理后,組織蛋白中的堿性基團(tuán)通過乙?;蛔钄?。組織和細(xì)胞標(biāo)本亦可用0.2M HCl處理10min,稀酸能使堿性蛋白變性,結(jié)合蛋白酶消化,容易將堿性蛋白移除。
      (2)去污劑處理:去污劑處理的目的是增加組織的通透性,利于雜交探針進(jìn)入組織細(xì)胞,zui常應(yīng)用的去污劑是Triton X-100。注意:過度的去污劑處理不僅影響組織的形態(tài)結(jié)構(gòu),而且還會引起靶核酸的丟失。
      (3) 蛋白酶處理:蛋白酶消化能使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露,以增加探針對靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K),還有鏈霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。
      雜交緩沖液孵育:
      雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2hr,以阻斷玻片和標(biāo)本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點(diǎn),達(dá)到減低背景的目的。
      防止污染:
      由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶,為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在整個(gè)雜交前處理過程中都需要戴消毒手套,實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫烘烤(180以達(dá)到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時(shí)所用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。
      雙鏈DNA探針和靶DNA的變性:
      雜交反應(yīng)進(jìn)行時(shí),探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進(jìn)行雜交包括檢測RNA時(shí),雙鏈DNA探針在雜交前必須進(jìn)行變性。探針變性后要立即進(jìn)行雜交反應(yīng),不然解鏈的探針又會重新復(fù)性。
      雜交液:
      雜交液內(nèi)除含一定濃度的標(biāo)記探針外,還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNARNA等。
      雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加,可以減低探針與組織標(biāo)本之間的靜電結(jié)合。甲酰胺可使Tm降低,雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA:RNARNA:DNA,DNA:DNA的雜交溫度降低0.350.50.65。所以,雜交液中加入適量的甲酰胺,可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標(biāo)本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結(jié)合,從而減少雜交液的有效容積,提高探針有效濃度,以達(dá)到提高雜交率的目的尤其對雙鏈核酸探針。在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNARNA等,都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合,以減低背景。
      探針的濃度:
      探針濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)要求略有不同,一般為0.5-5.0μg/ml(0.5-5.0ng/μl)。zui適宜的探針濃度要通過實(shí)驗(yàn)才能確定。
      探針的長度:
      一般應(yīng)在50-300個(gè)堿基之間,zui長不宜超過400個(gè)堿基。探針短易進(jìn)入細(xì)胞,雜交率高,雜交時(shí)間短。
      二、試劑準(zhǔn)備
      1 0.1M PBS (pH7.2)Na2HPO4•12 H2O 61.6g、NaH2PO4•2 H2O 5.6g、NaCl 9g,加ddH2O2000ml,高壓滅菌。
      2 0.2M PB ((pH7.2)Na2HPO4•12 H2O 61.6g、NaH2PO4•2 H2O 5.6g ddH2O1000ml,高壓滅菌。
      3 0.1M甘氨酸:0.75g甘氨酸溶于0.1M PBS,定容至100ml,高壓滅菌。
      4 4%多聚甲醛:多聚甲醛40gddH2O 400ml,加熱至70左右,用1M NaOH調(diào)pH7.0,用ddH2O定容至500ml,再加0.2M PB
      500ml
      ,總體積為1000ml
      5 16×Denhardt溶液:聚乙烯吡咯酮0.4g、小牛血清白蛋白(BSA 0.4g、聚蔗糖0.4g,加dd H2O10ml,無菌抽濾、分裝, -20保存?zhèn)溆谩?/span>
      6預(yù)雜交液:去離子甲酰胺10ml、50%硫酸葡聚糖4ml,于50促溶后,再依次加入16×Denhardt0.2ml1M Tris-HCl(pH 8.0) 0.2ml、5M NaCl 1.2ml、0.5M EDTA(pH 8.0) 0.04ml0.1M二硫蘇糖醇 2 ml、ddH2O 2.21ml,總體積為10ml。無菌抽濾、分裝,-20保存?zhèn)溆?。臨用前加入50mg/ml變性鮭魚精DNA 75μl/ml。
      7 20×SSC: NaCl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g,加水至800ml,用2N NaOH調(diào)pH7.0,再用ddH2O定容至1000ml。
      8抗體稀釋液:Triton X-100 80μl、BSA 0.2g,以0.05M PBS定容至20ml。
      9
      TSM1
      1M Tris-HCl(pH 8.0)10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml,加ddH2O 100ml。
        
      TSM2
      (新鮮配制):1M Tris-HCl(pH 9.5)10ml、5M NaCl 2ml1M MgCl2 1ml,加ddH2O100ml。
      顯色液(臨用前現(xiàn)配):5ml TSM2 加顯色液原液(NBT/BCIP150μl,并加適量左旋咪唑使其終濃度為0.24μg/ml,避光。
      三、操作步驟
      (一)取材、冰凍切片:
      將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉,打開胸腔,暴露心臟,刺破右心耳,將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注(灌注量約為動物體重的2倍),再注入等量的4%多聚甲醛。(見圖2-7)。取材,置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡沖洗4-5次(換液:1/hr)。將組織塊入30%蔗糖/0.1M PBS液(4),1-2天后冰凍切片,將切片裱貼于原位雜交玻片上,切片厚度為15-20μm。
      (二)探針制備與檢測(定量):
      1.隨機(jī)引物制備cDNA核酸探針以DIG DNA 標(biāo)記檢測試劑盒為例:
      1)探針制備:
      模板DNA(0.5-3μg) 15μl,100變性10min,冰浴5 min。
      在冰浴中加:Hexanucleotide mix 2μl, dNTPmix 2μlKlenow Enzyme 1μl,反應(yīng)總體積為20μl。37孵育過夜。
      在上述20μl的標(biāo)記產(chǎn)物中加4M LiCl 2.5μl75μl(無水預(yù)冷,輕輕混勻,-20放置 2hr。4離心12000g×15min,棄上清。70%預(yù)冷) 50μl洗滌,7500g×5min,棄上清,晾干沉淀,加TE 50μl溶解沉淀,-20保存?zhèn)溆谩?/span>
      2)探針敏感性檢測:
      樣品稀釋:取dig-標(biāo)記探針1μl ddH2O1:10、1:100、1:10001:1000、1:10000梯度稀釋。
      取一張與點(diǎn)樣器大小相近的尼龍膜,標(biāo)記方向,ddH2O中浸泡 1min,6×SSC中浸泡10min,置點(diǎn)樣器上,負(fù)壓抽吸5min。
      將上述樣品點(diǎn)于尼龍膜上,繼續(xù)抽吸10min。
      取下尼龍膜,置紫外燈下10cm處照射5min,晾干。
      將膜置于適量預(yù)雜交液(5-10 ml)中,37預(yù)雜交10min。
      加入Anti-dig 抗體(1:5000),37雜交30min。
      洗膜:2×SSC/0.1%SDS室溫洗10 min×2次。
      顯色:15 mlTSM2中加300μl顯色液(NBT/BCIP),37避光顯色30min。
      1 PCR法制備cDNA核酸探針:
      (1)探針制備:
      PCR DIG Probe Synthesis Kit 為例:
      0.5ml離心管中,依次加入:
      PCR引物 110pM 2μl;
      PCR引物 110pM 2μl;
      質(zhì)粒DNA 模板(10-100pg 2μl;
      PCR DIG mix 2μl (dNTPDIG-11-dUTP);
      dNTPmix 2μl;
      10×PCR buffer 5μl
      Taq 酶(2u/μl 1μl;
      加入適量ddH2O,使總體積達(dá)50μl。
      將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。
      一般:在93預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93 45s 58 45s 72 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72保溫7min。
      在上述PCR產(chǎn)物中加入4M LiCl 12.5μl、預(yù)冷無水375μl,輕輕混合后置于-202hr, 12,000g×15min,棄上清。70%預(yù)冷) 120μl洗滌沉淀,離心7500g×5min,棄上清,晾干沉淀,TE 50μl溶解,-20保存?zhèn)溆谩?/span>
      2)探針檢測:
      行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察DIG-DNA探針含量(采用目測法)。
      (三)原位雜交反應(yīng)(以DIG-cDNA探針為例):
      10.1M PBS (pH 7.2) 5-10min。
      20.1M甘氨酸/0.1M PBS 5min。
      30.3%TritonX-100/0.1M PBS 10-15min
      40.1M PBS 5min×3次,加蛋白酶K(1μg/ml),37孵育30 min。
      5 4%多聚甲醛浸5min。
      6 0.1M PBS 5min×2次,浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三胺中10min。
      7.預(yù)雜交:滴加適量預(yù)雜交液,42 30 min。
      <1>雜交:傾去預(yù)雜交液,在每張切片上滴加10-20μl雜交液(將探針變性后稀釋在預(yù)雜交液中,0.5 ng/μl ),覆以蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?/span>42過夜。
      <2>洗片:
      (1)
      4×SSC
      、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37各洗20min;
      0.2×SSC 3710min;0.2×SSC0.1M PBS各半洗10min;
      0.05M PBS 5min×2次。
      103% BSA/0.05M PBS 包被,37 30min。
      11.滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復(fù)合物(以抗體稀釋液1:5000稀釋)4孵育過夜。
      120.05M PBS15min×4次;TSM1 10min×2次;新鮮配制TSM2 10min×2次。
      13.顯色:在玻片上滴加適量顯色液,4避光過夜。
      14.將玻片置于TE10-30min以終止反應(yīng)。酒精梯度脫水、二甲苯脫脂,中性樹膠封片。
      15.顯微鏡下觀察結(jié)果。
      四、注意事項(xiàng):
      1.作為DNA-RNA的雜交,需防RNase的污染。
      2.cDNA探針在雜交時(shí)必須變性解鏈。具體方法是:將探針置100加熱5min,冰浴驟冷。
      關(guān)鍵詞:熒光顯微鏡
      全年征稿/資訊合作 聯(lián)系郵箱:1271141964@qq.com

      免責(zé)聲明

      • 凡本網(wǎng)注明"來源:智能制造網(wǎng)"的所有作品,版權(quán)均屬于智能制造網(wǎng),轉(zhuǎn)載請必須注明智能制造網(wǎng),http://towegas.com。違反者本網(wǎng)將追究相關(guān)法律責(zé)任。
      • 企業(yè)發(fā)布的公司新聞、技術(shù)文章、資料下載等內(nèi)容,如涉及侵權(quán)、違規(guī)遭投訴的,一律由發(fā)布企業(yè)自行承擔(dān)責(zé)任,本網(wǎng)有權(quán)刪除內(nèi)容并追溯責(zé)任。
      • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其它來源的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其內(nèi)容的真實(shí)性,不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),必須保留本網(wǎng)注明的作品來源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
      • 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。

      <
      更多 >

      工控網(wǎng)機(jī)器人儀器儀表物聯(lián)網(wǎng)3D打印工業(yè)軟件金屬加工機(jī)械包裝機(jī)械印刷機(jī)械農(nóng)業(yè)機(jī)械食品加工設(shè)備制藥設(shè)備倉儲物流環(huán)保設(shè)備造紙機(jī)械工程機(jī)械紡織機(jī)械化工設(shè)備電子加工設(shè)備水泥設(shè)備海洋水利裝備礦冶設(shè)備新能源設(shè)備服裝機(jī)械印染機(jī)械制鞋機(jī)械玻璃機(jī)械陶瓷設(shè)備橡塑設(shè)備船舶設(shè)備電子元器件電氣設(shè)備


      我要投稿
      • 投稿請發(fā)送郵件至:(郵件標(biāo)題請備注“投稿”)1271141964.qq.com
      • 聯(lián)系電話0571-89719789
      工業(yè)4.0時(shí)代智能制造領(lǐng)域“互聯(lián)網(wǎng)+”服務(wù)平臺
      智能制造網(wǎng)APP

      功能豐富 實(shí)時(shí)交流

      智能制造網(wǎng)小程序

      訂閱獲取更多服務(wù)

      微信公眾號

      關(guān)注我們

      抖音

      智能制造網(wǎng)

      抖音號:gkzhan

      打開抖音 搜索頁掃一掃

      視頻號

      智能制造網(wǎng)

      公眾號:智能制造網(wǎng)

      打開微信掃碼關(guān)注視頻號

      快手

      智能制造網(wǎng)

      快手ID:gkzhan2006

      打開快手 掃一掃關(guān)注
      意見反饋
      關(guān)閉
      企業(yè)未開通此功能
      詳詢客服 : 0571-87858618