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      熒光顯微鏡與普通顯微鏡的區(qū)別

      2011年06月17日 17:02:07人氣:811來源:江蘇同君科技儀器有限公司

             熒光顯微鏡是以紫外線為光源, 用以照射被檢物體, 使之發(fā)出熒光, 然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。

        細(xì)胞中有些物質(zhì),如葉綠素等,受紫外線照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光,但如果用熒光染料或熒光抗體染色后,經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光,熒光顯微鏡就是對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。

        熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別:

        1.照明方式通常為落射式,即光源通過物鏡投射于樣品上;

        2.光源為紫外光,波長較短,分辨力高于普通顯微鏡;

        3.有兩個(gè)特殊的濾光片,光源前的用以濾除可見光,目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線,用以保護(hù)人目。



        熒光顯微鏡的應(yīng)用與注意

        使用:

        一、將材料片放在顯微鏡的載物臺(tái)上。

        二、打開熒光顯微鏡穩(wěn)壓器,然后啟動(dòng)紫外燈,紫外燈15min內(nèi)不得關(guān)閉,關(guān)閉后3min內(nèi)不得再啟動(dòng)。

        三、將激發(fā)濾光片轉(zhuǎn)至v,分色片調(diào)到v,選用495或475nm阻擋濾光片。

        四、選用uvFL40、uvFL100熒光接物鏡鏡檢。

        五、在玻片上加無熒光油,先用40 x,再用100 x調(diào)焦鏡檢.呈現(xiàn)熒光。

        六、因熒光物質(zhì)受紫外光照射時(shí)隨時(shí)間的增長熒光逐漸變?nèi)酰虼绥R檢時(shí)應(yīng)經(jīng)常變換視野。

        七、亦可用uvFL10或uvFL20低倍鏡鏡檢材料(用低倍鏡時(shí)不加無熒光油)。

        熒光圖像的記錄方法:

        熒光顯微鏡所看到的熒光圖像,一是具有形態(tài)學(xué)特征,二是具有熒光的顏色和亮度,在判斷結(jié)果時(shí),必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo),即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察,基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展,在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果,如用細(xì)胞分光光度計(jì),圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果,也必須結(jié)合主觀的判斷。

        熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要,由于熒光很易褪色減弱,要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大,如FITC的標(biāo)記物,在紫外光下照射30s,熒光亮度降低50%。所以,曝光速度太慢,就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。

        注意事項(xiàng):

        (1)嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作,不要隨意改變程序。

       ?。?)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后,接上電源,點(diǎn)燃超高壓汞燈5~15min,待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后,眼睛*適應(yīng)暗室,再開始觀察標(biāo)本。

        (3)防止紫外線對(duì)眼睛的損害,在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。

        (4)檢查時(shí)間每次以1~2h為宜,超過90min,超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降,熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3~5min后,熒光也明顯減弱;所以,zui多不得超過2~3h。

       ?。?)熒光顯微鏡光源壽命有限,標(biāo)本應(yīng)集中檢查,以節(jié) 省時(shí)間,保護(hù)光源。天熱時(shí),應(yīng)加電扇散熱降溫,新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí),須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。

       ?。?)標(biāo)本染色后立即觀察,因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延緩熒光減弱時(shí)間,防止封裱劑蒸發(fā)。

       ?。?)熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn):一般分為四級(jí),即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光。“++”—可見有明亮。

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