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補(bǔ)體法
1.材料
(1)免疫血清 60℃ 滅活 20 min,用 Kolmers 鹽水作 2 倍稀釋成 1:2,1:4,1:8……。補(bǔ)體用 1:10 稀釋的新鮮豚鼠血清,抗補(bǔ)體熒光抗體等,按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià),如為 1:32 則免疫血清應(yīng)作 1:8 稀釋。
(2)補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作 1:10 稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測定的結(jié)果,按 2 單位的比例,用 Kolmers 鹽水稀釋備用。Kolmers 鹽水配法:即在 pH7.4、0.1mol/L 的磷酸緩沖鹽水中,溶解 MgSO4 的含量為 0.01% 濃度。
(3)抗補(bǔ)體熒光抗體:在免疫血清效價(jià)為 1:4,補(bǔ)體為 2 單位的條件下,用補(bǔ)體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià),然后按染色效價(jià) 1:4 的濃度用 Kolmers 鹽水稀釋備用。
2.方法步驟
(1)涂片或切片固定。
(2)吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液(此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍)滴于切片上,37℃ 作用 30 min,置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。
(3)用緩沖鹽水洗 2 次,攪拌,每次 5 min,吸干標(biāo)本周圍水液。
(4)滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體 30 min,37℃,水洗同(3)。
(5)蒸餾水洗 1 min,緩沖甘油封固。
3.對照染色
(1)抗原對照。
(2)抗血清對照:用正常兔血清代替免疫血清。
(3)滅活補(bǔ)體對照:將補(bǔ)體經(jīng) 56℃30 min 處理后,按補(bǔ)體同樣比例稀釋,與免疫血清等量混合后,進(jìn)行補(bǔ)體法染色。
本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制,因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用,敏感性亦較間接法高,效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用,節(jié) 省免疫血清,尤其是對檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時(shí)甚為理想。
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