1.怎么改變流動相比例來延長保留時間?

問題描述：

做的黃酮苷，用甲醇+乙腈+四氫呋喃+醋酸(1:1:19.4:78.6)溶液做流動相，現(xiàn)在分離效果不理想，想延長保留時間看看怎么樣，也就是增大流動相的極性，給點(diǎn)建議，謝謝！PS：用的C18柱。

解答：

用液相色譜，C18柱分離黃酮苷，不是太清楚為什么要選用甲醇+乙腈+四氫呋喃+醋酸這樣一種很復(fù)雜的流動相體系，難道體積分?jǐn)?shù)78.6%的醋酸是直接用的冰醋酸？這是一種很不可思議的流動相配比。建議直接使用甲醇-水，或是乙腈-水作為流動相，水相中可以適當(dāng)加點(diǎn)甲酸或是乙酸來得到分離效果。

2.保留時間為什么總在變？

問題描述：

苯甲酸的測定中流動相走了很久，進(jìn)樣以后，保留時間還是變，難道這個項目的柱子這么難平衡么？

解答：

保留時間一直在變，說明系統(tǒng)沒有平衡好，可以從多個方面去排查原因。

a.流動相可能是最主要的原因，流動相平衡時間是否充足，管路有沒有氣泡，流動相中有機(jī)相是否蒸發(fā)，比例閥工作是否正常？

b.泵有可能存在問題，輸液是否正常，壓力是否穩(wěn)定，泵密封墊是否完好，是否有漏點(diǎn)？

c.色譜柱也需要排查，是否恒溫，是否有漏液？

3.液相色譜中影響峰擴(kuò)散的有那些因素？

問題描述：

液相色譜中影響峰擴(kuò)散的有那些因素？與氣相色譜相比，有哪些不同之處？

解答：

氣相色譜與液相色譜在速率理論方程上的差異主要是由于氣體與液體的性質(zhì)差異造成的。液體的黏度比氣體大約100倍，表面張力大約10000倍，密度大約1000倍；氣體還具有高壓縮性系數(shù)。溶質(zhì)在液體中的擴(kuò)散系數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于在氣體中，液相在傳質(zhì)過程中對理論塔板高度的影響尤其的大。與氣相色譜速率理論方程不同的是，液相色譜增加了固定相孔結(jié)構(gòu)內(nèi)滯留流動相傳質(zhì)項。

因此我們可以得知主要有以下幾個方面會影響色譜峰擴(kuò)張：

1.渦流擴(kuò)散

渦流擴(kuò)散是由于柱填料粒徑大小不同及填充不均勻等因素造成的流動相在色譜柱內(nèi)遷移過程中發(fā)生的渦流運(yùn)動。

2.分子擴(kuò)散

分子是由于進(jìn)樣后，溶質(zhì)分子在柱內(nèi)縱軸上存在濃度梯度，引起濃差擴(kuò)散而使譜帶展寬。由于液體流動相的傳質(zhì)速度較慢，分子擴(kuò)散項B/u可以忽略不計。

3.傳質(zhì)阻力

溶質(zhì)分子與固定相、流動相分子間存在相互作用，擴(kuò)散、分配、轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達(dá)到平衡，實際傳質(zhì)速度是有限的，總是存在超前與滯后現(xiàn)象。這使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。

4 流速

一般難以觀察到H對應(yīng)的流速，因為流速降低，H總是降低。當(dāng)u>uopt時，H隨著u升高而升高，傳質(zhì)引起的色譜峰擴(kuò)張也會更明顯。

5 固定相顆粒大小

渦流擴(kuò)散項A和流動相傳質(zhì)阻力項Cm均與柱填料粒徑dp的平方成正比，所以固定相粒徑與色譜峰擴(kuò)張有很大的關(guān)系。

6 柱溫

色譜柱溫直接影響到分子在固定相和流動相中的擴(kuò)散系數(shù)DS和Dm，從而影響分子擴(kuò)散和傳質(zhì)的速率。柱溫升高，DS和Dm升高，分子擴(kuò)散導(dǎo)致柱效降低；而傳質(zhì)改善又導(dǎo)致柱效升高；因此柱溫對色譜峰擴(kuò)張的影響是矛盾的。

4.液相色譜使用緩沖鹽的注意事項

解答：

1、避免使用鹽酸鹽，鹽酸鹽對鋼質(zhì)有腐蝕作用。

2、緩沖液要現(xiàn)配現(xiàn)用，往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液，隔天或放置長時間實驗時會有很多怪現(xiàn)象發(fā)生。

3、實驗后不可用有機(jī)溶劑直接過度，有機(jī)溶劑會處使鹽類析出，造成液路或色譜柱堵塞，可用95：5的水甲醇沖洗。

4、使用緩沖液要及時掌握pH范圍，做到胸中有數(shù)。

5、清洗液路和柱子時，有溫控可加熱到30℃易于沖洗。

6、長時間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無析出，若有白色鹽類析出，可考慮一定周期用10%硝酸沖洗一下液路(拆下柱子，走30ml，再用5倍水沖洗)可以避免液路的堵塞。

7、選擇緩沖液要用可靠的試劑，避免不純的鹽類造成不必要的麻煩。

如果流動相中有機(jī)溶劑的比例很高是不能用來沖洗緩沖鹽的，是洗不出來的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇沖洗，是可以把緩沖鹽沖洗出來的，然后用純的有機(jī)溶劑來保護(hù)柱子。方法是使用與流動相相同濃度不含鹽的流動相進(jìn)行清洗。但就是速度慢一些。用水是為了快速替換，一般在15分鐘以內(nèi)，且用0.8的流速較好。如果用純水沖，容易造成鍵合的碳鏈的流失，用5%~10%甲醇水溶液沖。可以用純水代替流動相中的緩沖液，有機(jī)相不變。這樣沖洗柱子比較穩(wěn)妥。