一、微量凱氏（kjeldahl）定氮法---/

樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以*為例，其反應(yīng)式如下：

NH₂ CH₂ COOH+3H₂ SO₄ ――2CO₂ +3SO₂ +4H₂O+NH₃ （1）

2NH₃ +H₂ SO₄ ――（NH₄ ）₂ SO₄ （2）

（NH₄ ）₂ SO₄ +2NaOH――2H₂ O+Na₂ SO₄ +2NH₃ （3）

反應(yīng)（1）、（2）在凱氏瓶?jī)?nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。

為了加速消化，可以加入CuSO₄作催化劑，K₂SO₄以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。

計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白

氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、雙縮脲法（biuret法）

（一）實(shí)驗(yàn)原理

雙縮脲（NH₃CONHCONH₃）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO₄形成紫色絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。

紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分的蛋白質(zhì)測(cè)定。

（二）試劑與器材

1.試劑：

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（bsa）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來(lái)校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱(chēng)量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H₂O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。

（2）雙縮脲試劑：稱(chēng)以1.50克硫酸銅（CuSO₄•5H₂O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC₄H₄O₆•4H₂O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。

2.器材：

可見(jiàn)光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。

（三）操作方法

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20～25℃）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的*支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、樣品的測(cè)定：取2～3個(gè)試管，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過(guò)10mg/ml。

三、folin―酚試劑法（lowry法）

（一）實(shí)驗(yàn)原理

這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是zui靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用zui廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購(gòu)），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin―酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin―酚試劑中的磷鉬酸鹽―磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的*和苯*殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

folin―酚試劑法zui早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、*、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉―氫氧化鈉溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉―氫氧化鈉溶液的濃度1～2倍。

進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加folin―酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性ph條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在ph=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)folin一酚試劑加到堿性的銅―蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸―磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。

此法也適用于*和*的定量測(cè)定。

此法可檢測(cè)的zui低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。