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要一次進(jìn)行這么多種反應(yīng),我們當(dāng)然不想在反應(yīng)中缺了哪個(gè)組分。一般多重PCR需要更多的dNTP、鎂離子和聚合酶。Nichols推薦使用0.3 mM dNTP(而非標(biāo)準(zhǔn)的0.2 mM)、2.5 mM Mg2+(而非1.2至2 mM)以及每50μL反應(yīng)體系5 units聚合酶(而非1.25 units)。zui后再試試鹽濃度,“在優(yōu)化的時(shí)候,增加鹽總會(huì)有幫助,尤其能增加特異性?!?a data-cke-saved-href="http://towegas.com/st51173/list_161473.html" href="http://towegas.com/st51173/list_161473.html">ELISA試劑盒
PCR master mix含有緩沖液、鹽、dNTP、Mg和聚合酶,如果我們使用常規(guī)1.25× 或1.5×的PCR master mix就已經(jīng)差不多做到了上述原則的三至五。另外,您還可以選用轉(zhuǎn)為多重PCR優(yōu)化的產(chǎn)品,例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ? Multiplex Powermix、或者安捷倫的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。
據(jù)安捷倫的Mason介紹,Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的,能夠很好的解決同一管中不同反應(yīng)相互競(jìng)爭(zhēng)的問(wèn)題。如果一個(gè)目標(biāo)片段出現(xiàn)1000次,而另一個(gè)目標(biāo)片段只出現(xiàn)了10次,那么后一個(gè)片段就很容易淪為背景?!拔覀兊亩嘀豍CR試劑盒能夠在同一個(gè)管中準(zhǔn)確定量低豐度和高風(fēng)度的目標(biāo)片段,克服偏向性,”Mason說(shuō)。
我能擴(kuò)多少目標(biāo)片段一般來(lái)說(shuō),zui多能在同一個(gè)管中同時(shí)檢測(cè)到五個(gè)目標(biāo)片段,這既是出于引物設(shè)計(jì)的考慮,也是由多重定量PCR的硬件條件決定的。實(shí)時(shí)熒光PCR儀通常zui多檢測(cè)4至5個(gè)顏色通道,其中一個(gè)可能還要留作參考通道。凝膠電泳雖然不受此限制,但多引物一同作用仍然存在困難,因此還是zui多達(dá)到五重PCR。 “設(shè)計(jì)更多是挑戰(zhàn)性的,”Cockrum說(shuō)。
多重定量PCR的染料能進(jìn)行多重定量PCR的儀器包括:Life Tech公司的QuantStudio? 12K Flex Real-Time PCR System、安捷倫公司的Mx30005P等等。目前zui流行的選擇是HEX、FAM和VIC,而FAM/HEX和FAM/VIC是用的zui普遍的。Life Tech除了VIC外,近期又發(fā)布了兩個(gè)新染料ABY和JUN以及一個(gè)新passive reference dye——Mustang Purple。ELISA試劑盒
Cockrum建議將染料強(qiáng)度與模板豐度結(jié)合起來(lái),用zui亮的染料(通常是FAM)配zui少的模板,用zui黯淡 的染料(例如Cy5或Quasar 705)配豐度zui高的模板(如看家基因)。
更多重的PCR當(dāng)然,引物設(shè)計(jì)是多重PCR的zui大障礙,不過(guò)一旦克服了這一障礙我們就能進(jìn)行更多重的PCR反應(yīng)。安捷倫的MassCode技術(shù)就能夠超越定量PCR儀帶來(lái)的硬件限制,安捷倫公司將這一技術(shù)推薦給那些想要同時(shí)篩選十個(gè)以上目標(biāo)片段的用戶(hù),例如可以用來(lái)檢測(cè)病原體。ELISA試劑盒
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展會(huì)城市:上海市展會(huì)時(shí)間:2025-06-18