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      外源基因的誘導表達

      2013年01月08日 13:08:56人氣:1504來源:上海研生生化試劑有限公司

       外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動子的表達系統(tǒng)中。先讓宿主菌生長,lac I產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結合抑制下游的外源基因轉錄。向培養(yǎng)基中加入誘導物IPTG(異丙基硫代-b-D-半乳糖),解除抑制使外源基因大量表達。表達的蛋白可經(jīng)SDS-PAGE或Western-blotting檢測。

       

      1.目的

      了解外源基因在原核細胞中表達的特點和方法。

      2.原理

      外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動子的表達系統(tǒng)中。先讓宿主菌生長,lac I產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結合抑制下游的外源基因轉錄。向培養(yǎng)基中加入誘導物IPTG(異丙基硫代-b-D-半乳糖),解除抑制使外源基因大量表達。表達的蛋白可經(jīng)SDS-PAGE或Western-blotting檢測。

      3.器材

      旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,50ml 微量離心管,1.5ml 微量離心管,雙面微量離心管架,臺式冷凍離心機,制冰機,恒溫搖床,分光光度計,超凈工作臺,恒溫培養(yǎng)箱,搖菌試管,三角燒瓶,接種環(huán)。

      4.試劑

      LB培養(yǎng)基(加抗菌素),100mg/ml IPTG,20%葡萄糖。

      5.實驗準備

      無菌ddH2O,1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌),牙簽(滅菌),搖菌管(滅菌),100mg/ml IPTG (過濾滅菌)(100ml分裝,-20°C保存),100mg/ml氨芐青霉素(過濾滅菌)(100ml分裝,-20°C保存),配制20%葡萄糖(8磅滅菌20分鐘,添加至上述LB中,終濃度為0.2%)。

      6.操作步驟

      (1) 晚上9:00接種。在超凈工作臺中接種含有Pinpoint™xa-3-CHI重組載體的菌株,培養(yǎng)于兩個三角燒瓶各20ml LB-葡萄糖培養(yǎng)基(含抗菌素Amp 120μg/ml)的搖菌管中,慢速70~90轉/分鐘30°C搖菌過夜。

      (2) 至第二天上午8:30 OD600約為0.5,加IPTG至 100μg/ml,150~170轉/分鐘37°C誘導1.5-3h。同時做不加IPTG誘導和非轉化的空菌誘導的對照培養(yǎng)。

      (3) 4000rpm離心15min棄掉上清液,收獲菌體,用SDS-PAGE電泳分析(表達蛋白分子量為30kDa)。菌體也可放在-20°C以下保存?zhèn)溆谩?/p>

      (4) 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面。

      詳細請看:外源基因的誘導表達

      關鍵詞:分光光度計
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