外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動子的表達系統(tǒng)中。先讓宿主菌生長，lac I產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結合抑制下游的外源基因轉錄。向培養(yǎng)基中加入誘導物IPTG（異丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表達。表達的蛋白可經(jīng)SDS-PAGE或Western-blotting檢測。

1．目的

了解外源基因在原核細胞中表達的特點和方法。

2．原理

外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動子的表達系統(tǒng)中。先讓宿主菌生長，lac I產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結合抑制下游的外源基因轉錄。向培養(yǎng)基中加入誘導物IPTG（異丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表達。表達的蛋白可經(jīng)SDS-PAGE或Western-blotting檢測。

3．器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)。

4．試劑

LB培養(yǎng)基（加抗菌素），100mg/ml IPTG，20%葡萄糖。

5．實驗準備

無菌ddH2O，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌），牙簽（滅菌），搖菌管（滅菌），100mg/ml IPTG （過濾滅菌）（100ml分裝，-20°C保存），100mg/ml氨芐青霉素（過濾滅菌）（100ml分裝，-20°C保存），配制20%葡萄糖（8磅滅菌20分鐘，添加至上述LB中，終濃度為0.2%）。

6．操作步驟

（1） 晚上9：00接種。在超凈工作臺中接種含有Pinpoint™xa-3-CHI重組載體的菌株，培養(yǎng)于兩個三角燒瓶各20ml LB-葡萄糖培養(yǎng)基（含抗菌素Amp 120μg/ml）的搖菌管中，慢速70~90轉/分鐘30°C搖菌過夜。

（2） 至第二天上午8：30 OD600約為0.5，加IPTG至 100μg/ml，150~170轉/分鐘37°C誘導1.5-3h。同時做不加IPTG誘導和非轉化的空菌誘導的對照培養(yǎng)。

（3） 4000rpm離心15min棄掉上清液，收獲菌體，用SDS-PAGE電泳分析（表達蛋白分子量為30kDa）。菌體也可放在-20°C以下保存?zhèn)溆谩?/p>

（4） 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面。

詳細請看：外源基因的誘導表達