光片顯微鏡（大樣品組織器官成像系統(tǒng)）—LSM

類器官3D成像系統(tǒng)

       傳統(tǒng)顯微鏡的小范圍的成像并不能反映組織的生物學狀態(tài)，而采用傳統(tǒng)的連續(xù)切片法又很容易導致樣品扭曲變形。因此迫切需要一種能夠?qū)崿F(xiàn)大樣品塊、快速掃描、深度成像、高分辨率3D動態(tài)圖像輸出的熒光顯微鏡。而光片顯微成像系統(tǒng)滿足了科研人員的這種需求。

光片顯微鏡系統(tǒng)用于細胞水平、透明化處理后腦、小鼠胚胎、組織、器官的大樣品整體成像或者斑馬魚等活樣品成像；在細胞凋亡、細胞周期、細胞毒作用、受體蛋白轉(zhuǎn)位、蛋白相互作用等許多方面都有很好的應用，可用于細胞生物學，系統(tǒng)生物學，類器官培養(yǎng)后的評估以及腫瘤學等研究。 功能用途：光片顯微成像系統(tǒng)應用范圍十分廣,可用于透明化處理后腦、小鼠胚胎或者器官，包括骨骼、脊髓、軟骨以及四肢等大樣品整體成像或者斑馬魚活樣品成像。

借助于光片照明顯微鏡，發(fā)育學家可以觀察到動物和人類胚胎模型各個階段的組織狀態(tài)，神經(jīng)學家能夠輕松的研究神經(jīng)元的再生能力并探究新的神經(jīng)傳導途徑，腫瘤學家可以準確的篩選血管抑制劑類藥物，免疫學家能夠研究淋巴系統(tǒng)整體的發(fā)育過程。光片顯微成像系統(tǒng)除了可以觀察透明化的樣品外，還可以實現(xiàn)動物的體內(nèi)成像。對于表達內(nèi)源性熒光蛋白或者標記了熒光抗體的組織也可以快速便捷地成像。

光片顯微鏡—LSM的系統(tǒng)化服務方案包括專業(yè)化的硬件、專業(yè)化的軟件、透明化方案、技術(shù)服務

適用于各種水性和有機透明劑處理后的樣品成像，同時適用于各種自然透明模式生物的成像；

支持各種折射率的透明劑，可軟件設(shè)定透明劑折射率以使所用光片與透明劑折射率相匹配，包括水及所有透明試劑（/cubic/scale/TDE/ClearT/Clarity/SeeDB/BABB/THF-DBE/Fruit等）；

適合樣品尺寸范圍為5μm到2 cm，視野范圍從6 mm至87 mm；

樣品池電動行程：2cm x 2cm x 2cm (X - Y - Z)； 可對大尺寸樣品進行單細胞分辨率的深層成像，可觀察超厚樣品，成像深度可達2 cm，成像尺寸約為2 cm X 2cm X 2 cm；

采用2光片照明方式，光片厚度約為2.7微米到24微米可調(diào)，具有極低的光漂白與光毒性； 

采用雙側(cè)光片照明方式，可以消除圖像中的陰影；

光片水平方向可自動調(diào)整聚焦點位置，支持動態(tài)水平對焦功能，以保證大樣品成像時圖像各處都能達到的成像質(zhì)量（包括手動移動光片，自動步進式移動光片，自動連續(xù)移動光片）；

采用多波長激光器，標配405nm，488nm， 532nm,  633nm ，其他波段可選，最多可同時配置6個波長；

可配備0.63X齊焦電動變倍體，具備0.63X~6.3X光學連續(xù)變倍體，整套設(shè)備的放大倍數(shù)為1.26X~12.6X；

可配備0.63X，1X，2X物鏡；

可配備高分辨率多浸成像模塊，10X物鏡（NA 0.5，工作距離5.5mm，）， 20X的定倍物鏡（NA 1.0， 工作距離8.2mm）；

高分辨率相機：sCMOS，分辨率為2048 x 2048，幀速100 fps@全幅分辨率，用于快速功能成像；

軟件可實現(xiàn)數(shù)據(jù)獲取與處理，并控制所有硬件，進行成像控制及光片照明控制。支持多通道快速切換；

支持多視場自動成像拼接，Z-stack，時間序列（含XYZT）成像，多維(x, y, z, t, λ)數(shù)據(jù)堆棧與分析。

光片顯微鏡樣品處理-組織透明化技術(shù)

如今，組織樣品的透明化已經(jīng)成為神經(jīng)生物學和發(fā)育生物學等研究領(lǐng)域中的核心技術(shù)手段。

為什么要進行組織透明化處理？

傳統(tǒng)的成像技術(shù)在觀察大型生物樣品時，一般采用連續(xù)切片法，然后將組織的切片置于顯微鏡下觀察，最后通過軟件將圖像進行整合形成立體影像圖。然而這種連續(xù)切片的方法很容易破壞組織的原有形態(tài)，對組織造成不規(guī)則的扭曲，導致不可逆的破壞。那么如何才能避免光的散射、吸收以及發(fā)射造成的影響從而獲得真實的全組織三維圖像呢？組織透明化技術(shù)的出現(xiàn)非常好的解決了這些問題。“clearing-透明化”這一概念由Werner Spalteholz 在1911年進行了詳細的闡述。他開發(fā)出了的組織透明化方法之一：用甲基水楊酸酯/苯甲酸苯甲酯（5:3）混合液對組織進行透明化處理，而當時也有學者使用含有丁香油或者二甲苯的香脂來做透明化處理。隨著技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)有的組織透明化處理的方案大約有30多種，主要分為兩類：基于水溶性緩沖液的方案和基于有機溶劑的方案。

一、基于水溶性緩沖液的組織透明化方案：

水溶性緩沖液的組織透明化方案有很多種，根據(jù)原理又可以分為三類：水凝膠法（hydrogel）、水化法（hyperhydration）和浸入法（immersion）。

（1）水凝膠法

CLARITY技術(shù)、PACT &PARS技術(shù)、SE-CLARITY技術(shù)、SWITCH技術(shù)、EDC-CLARITY技術(shù)和ACT-PRESTO 技術(shù)可歸為水凝膠法。該方法需要先用水凝膠將組織進行固定，然后利用SDS電泳去除脂肪，具體步驟可以參考CLARITY技術(shù)。這種方法的好處在于能夠完整的保留內(nèi)源性的熒光蛋白，同時組織基本不會膨脹。每種組織需要采用不同的技術(shù)手段，并且做特定的優(yōu)化處理?？梢詫⒔M織浸入到FocusClear，RapiClear，80％甘油，63％TDE，sRIMS或RIMS之中進行成像。這些溶液的價格大為8-6000美金/500 ml，其中8美金的sRIMS溶液或者63%的TDE溶液是的。

（2）水化法

水化法的主要代表是CUBIC技術(shù)，使用尿素、氨基醇類等多種試劑的混合液對組織進行浸泡處理，能夠?qū)崿F(xiàn)對小鼠腦甚至整個小鼠的透明化。經(jīng)過reagent-1處理之后，還需要reagent-2浸泡，根據(jù)樣品的大小，浸泡時間大概需要12天。CB-perfusion 技術(shù)[8]采用稀釋的溶液-1進行浸泡可以有效的提高富含血液組織的脫色效果，然后再用CUBIC reagent-2浸泡。處理后的樣品可長期保存于50%礦物油+50%硅油混合物中。其他的水化法的技術(shù)還有Scale技術(shù)[9], ScaleA2技術(shù)[9] 和 ScaleS技術(shù)，這些技術(shù)所需的浸泡時間比較長，可能需要數(shù)周，因此組織可能會膨脹的更明顯。

（3）浸入法

SeeDB技術(shù) 和FRUIT技術(shù)屬于浸入法，其共同點在于使用高濃度的果糖浸泡后，組織可以變得透明。然而在成年動物或者致密的組織中，經(jīng)過浸泡處理可能會增加成像背景并降低透明度。Viscose緩沖液浸泡后由于殘留的氣泡會降低成像質(zhì)量。SeeDB2技術(shù)的浸泡緩沖液是和皂素的混合液，ClearT技術(shù)相對比較簡單，適用于胚胎組織的透明化。

二、基于有機溶劑的組織透明化方案：

水溶性緩沖液的組織透明化方案有很多種，根據(jù)原理又可以分為三類：水凝膠法（hydrogel）、水化法（hyperhydration）和浸入法（immersion）。

基于水溶性緩沖液的組織透明化方案成本比較高而且費時費力，同時由于解聚化試劑的使用使得組織明顯膨脹，在某些情況下由于組織的不透明性甚至會阻礙處理的程序。而基于有機溶劑的組織透明化方案能夠彌補這些不足。基于有機溶劑的組織透明化方案在幾個小時之內(nèi)就可以完成組織的初步透明化。而針對那些比較致密和比較大型的組織，比如成年動物的腫瘤或者器官可以在兩天內(nèi)完成透明化。而且有機溶劑透明化方案花費也比較少，一般在幾美金左右?；谟袡C溶劑的組織透明化方案主要為兩步：步脫水，第二步透明，最終的折射率達到1.33。最初由Spalteholz發(fā)展的透明方法經(jīng)過修正和優(yōu)化之后很快就成為標準的方法。使用甲基水楊酸酯/苯甲酸苯甲酯、BBAB消除內(nèi)源性的熒光，德國科學家Dodt建立的3DISCO 技術(shù)能夠?qū)?nèi)源性熒光保留一段時間。Dodt也一直在研究更加穩(wěn)定的DISCO (sDISCO)，以期延長內(nèi)源性熒光保留時間。2013年，Alain Chédotal 改進了3DISCO技術(shù)，他認為：“3DISCO技術(shù)應該和免疫熒光染色一樣，經(jīng)過改進就能夠?qū)崿F(xiàn)對大組織樣品的全標本染色”。2014年Jean-François Brunet將這個技術(shù)發(fā)表在Science雜志上。Chédotal 實驗室的Nicolas Renier在此基礎(chǔ)上又進行了完善，命名為iDISCO技術(shù)。

之后他又發(fā)明了iDISCO+技術(shù)，Nicolas Renier解釋了iDISCO+技術(shù)的優(yōu)勢：“采用比較溫和的辦法，盡可能地兼顧了提高透明度（需要劇烈處理以去除脂肪）和保留蛋白質(zhì)內(nèi)源性熒光（需要溫和處理組織）。采用iDISCO+技術(shù)，不僅能夠達到類似3DISCO水平的透明度，而且保留了更多的內(nèi)源性螢光信號，最終我們可以同時獲得偶聯(lián)的熒光素信號和有機溶液中的脂質(zhì)提取物”。iDISCO技術(shù)可以將微弱的內(nèi)源性螢光信號進行免疫標記，最終增強放大。 其他的有機溶劑的組織透明化方案比如FluoClearBABB 技術(shù)[17], uDISCO技術(shù)[18], 和ECi技術(shù)也能夠達到保留內(nèi)源性熒光的效果。uDISCO技術(shù)具有更強的收縮樣品能力，可以輕松實現(xiàn)大樣品——比如整個小鼠的成像。而針對某些不適合劇烈收縮的樣品，無毒性的ECi技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)更好的成像，ECi技術(shù)甚至能夠?qū)⒐趋肋M行透明化從而實現(xiàn)對骨髓的成像。Visikol HISTO是一種商品化的可逆且無損的有機透明劑，可以實現(xiàn)對樣品的三維成像，隨后樣品還可以進行組織學的其他處理。

總結(jié)： 優(yōu)于透明化會改變樣品本身的性質(zhì)，所以處理過程通常都會引入一定的人造假象，所以針對特定的樣品，需要對特定的方法進行一定的優(yōu)化。相比較兩類不同的透明化方案，3DISCO技術(shù)和ECi技術(shù)耗時短、花費少。相對于sDISCO技術(shù)、uDISCO技術(shù)和ECi技術(shù)，CLARITY技術(shù)和CUBIC技術(shù)雖然能夠較好的保留內(nèi)源性熒光、達到良好的透明化效果，但是保留時間短、花費高也限制了其使用。對于大型組織樣品的深度成像，經(jīng)過遠紅外染料如Cy7和Alexa790標記后，采用iDISCO技術(shù)能夠得到十分出色的成像效果。而此時一般不適合用DAPI進行染核，而改用TO-PRO-3。采用標準的脫水方法（先用乙醇然后再用甲醇）可以避免樣品收縮，降低成像背景。

光片顯微鏡的應用領(lǐng)域

1、發(fā)育生物學： 光片顯微鏡可用于哺乳動物發(fā)育過程胚胎的成像。

在哺乳動物發(fā)育過程中，主靜脈血管中的內(nèi)皮細胞亞群表達淋巴管特異基因，進而發(fā)育出初級的淋巴結(jié)構(gòu)-淋巴囊。淋巴內(nèi)皮細胞的產(chǎn)生經(jīng)過了出芽，擴展和膨脹的過程，但是淋巴管形成的確切機制仍然不清楚。使用光片顯微鏡來觀察整體免疫染色的小鼠胚胎，我們以細胞水平的分辨率觀察到了完整的發(fā)育中的血管系統(tǒng)。實驗發(fā)現(xiàn)的淋巴內(nèi)皮細胞寬松地連接了主靜脈和淺靜脈叢，進而聚集產(chǎn)生了兩個新發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)構(gòu)，背部外周縱向淋巴管和腹側(cè)初級胸導管，最后與主靜脈相連。進一步研究其功能，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子C和基質(zhì)組分CCBE1對于淋巴內(nèi)皮細胞出芽和遷移是必需的。有報道研究使用光片顯微鏡詳細觀察了淋巴管的發(fā)育并構(gòu)建了新的模型。

經(jīng)過幾個世紀的研究，人類的生長于發(fā)育過程中仍遺留有很多的未解之謎。人類胚胎發(fā)育的研究始于20世紀，一般以觀察胚胎的組織圖像的方式來研究如器官發(fā)生的機制等，傳統(tǒng)的方式如切片一直使用至今?，F(xiàn)今，對于胚胎3D圖像的數(shù)字化構(gòu)建也已經(jīng)開始，使用核磁共振、X光攝影等方法均可獲得胚胎的3D圖像，但分辨率仍無法達到細胞水平。已報道文章，使用妊娠期6-14周的胚胎，結(jié)合免疫染色、3DISCO組織透明技術(shù)和光片顯微鏡，獲得了人類胚胎細胞級分辨率的3D圖像，清晰地顯示了胚胎的外周神經(jīng)、肌肉、血管、心、肺和泌尿系統(tǒng)。通過這種方法，我們可以建立人類生長發(fā)育的圖庫，研究人類胚胎發(fā)育的分子機制。

2、腫瘤學：光片顯微鏡可用于于腫瘤模型等樣品的成像。

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生通常伴有血腦屏障的損壞，導致大分子物質(zhì)可以通過血腦屏障達到腫瘤處，然而使腫瘤處的藥物達到濃度仍是腦瘤治療的難題，需要對腫瘤處的藥物活性進行研究。實驗使用了非侵入性的成像方法對細胞凋亡進行縱向監(jiān)測來研究注射的DR5抗體在腦瘤異體移植模型中的穿透性和藥效性。腦瘤模型通過植入表達熒光素酶的腫瘤細胞系建立。對細胞凋亡進行實時記錄，并通過光片顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不到1%的抗體到達了腫瘤處，而引發(fā)的細胞凋亡在24小時內(nèi)迅速降低，然而結(jié)果表明了抗腫瘤的效 果的存在，且抗體的穿透性隨血腦屏障的損壞而上升。光片顯微鏡能夠?qū)崿F(xiàn)腦瘤中的抗體聚集和藥效性的量化，用于評估中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向藥物。

3、神經(jīng)生物學：光片顯微鏡可用于于腦組織等樣品的成像。

當研究小鼠腦部同時需要保留其3D結(jié)構(gòu)時，則需要對腦做組織透明。3DISCO是一種非常簡單的組織透明化技術(shù)，經(jīng)常用于表達GFP的轉(zhuǎn)基因鼠腦組織。3DISCO技 術(shù)在與光片顯微技術(shù)結(jié)合后可以快速地生成軸突束的三維圖像。然而，像GFP的熒光在透明化后會迅速地消失。盡管有多種組織透明化技術(shù)可很好地保持熒光強 度，這些方法往往很復雜，耗時長達數(shù)天甚至數(shù)周，而且適用范圍較小。經(jīng)過試驗，在對腦組織進行免疫染色后再進行3DISCO透明化，可以使熒光染料保持活性長達數(shù)月，并同時保證了實驗效率。有報道，研究人員使用了光片顯微鏡和共聚焦顯微鏡。光片顯微鏡使用單側(cè)光源對后屈束和松果體韁成像僅用了10分鐘；使用雙側(cè)光源對全腦成像僅用時1小時。而共聚焦顯微鏡僅對后屈束成像就使用了4小時。使用光片顯微鏡顯著提高了成像速度。

4、模擬疾病模型：光片顯微鏡可用于于疫病相關(guān)的組織器官等樣品的成像。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在能量代謝中發(fā)揮著重要的作用；當這樣的神經(jīng)調(diào)控機制出現(xiàn)問題時會使得能量代謝失去平衡，產(chǎn)生肥胖、二型糖尿病或其他的失調(diào)現(xiàn)象。白色脂肪組織是機體代謝平衡調(diào)節(jié)的重要組成部分。機體生理狀態(tài)下，以脂肪形式存儲和釋放能量，維持代謝穩(wěn)態(tài)。白色脂肪組織在生理和病理條件下發(fā)生顯著變化，對整體的代謝穩(wěn)態(tài)和系統(tǒng)性炎癥產(chǎn)生廣泛影響，深入了解其調(diào)控機制對于理解和治療肥胖癥、2型糖尿病等代謝類疾病有著重要指導意義。研究顯示，在低溫條件下，白色脂肪組織發(fā)生明顯的細胞及分子水平變化，高表達Ucp1蛋白的細胞類型數(shù)目明顯增多，而該類細胞被認為在調(diào)節(jié)代謝平衡中發(fā)揮重要功能。在該報道的研究中發(fā)現(xiàn)，白色脂肪組織中分布高密度的交感神經(jīng)纖維，并且低溫條件刺激激活交感神經(jīng)元，其活動對白色脂肪組織在低溫刺激下的棕化反應有重要促進功能，揭示了白色脂肪組織受神經(jīng)活動調(diào)控的重要生理基礎(chǔ)。

類器官串聯(lián)芯片培養(yǎng)系統(tǒng)--- HUMIMIC的應用案例     

HUMIMIC應用案例-1：神經(jīng)球和肝臟在芯片上的串聯(lián)共培養(yǎng)
2015, Journal of Biotechnology, 
A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing

目前用于藥物開發(fā)的體外實驗平臺無法模擬人體器官的復雜性，而人類和實驗室動物的系統(tǒng)差異巨大，因此現(xiàn)有的方案都不能準確預測藥物的安全性和有效性。德國、葡萄牙和俄羅斯的研究團隊通過TissUse GmbH公司的微流控多器官芯片（MOC）平臺，測試毒物對多器官的作用，揭示了基于微流控的多器官串聯(lián)共培養(yǎng)能夠更好的模擬人體的生理學環(huán)境。在體外培養(yǎng)條件下，由于氧氣和營養(yǎng)供應有限，類器官培養(yǎng)往往會隨著時間的推移而去分化。然而微流控系統(tǒng)中通過持續(xù)灌注培養(yǎng)基，更好地控制環(huán)境條件，如清除分泌物和刺激因子，并且培養(yǎng)基以可控流速通過，以模擬血流產(chǎn)生的生物剪切應力，因此類器官培養(yǎng)物可以保持良好的生長狀態(tài)。

雙器官串聯(lián)芯片（2-OC）能夠串聯(lián)共培養(yǎng)人的神經(jīng)球（NT2細胞系）和肝臟類器官（肝HepaRG細胞和肝HHSteC細胞）。在持續(xù)兩周的實驗中，反復加入神經(jīng)毒劑2,5-己二酮，引起神經(jīng)球和肝臟的細胞凋亡。跟單器官培養(yǎng)相比，串聯(lián)共培養(yǎng)對毒劑更敏感。因此，多器官串聯(lián)共培養(yǎng)在臨床研究中可以更準確地預測藥物的安全性和有效性。推測這是因為一個類器官的凋亡信號導致了第二個類器官對藥物反應的增強，這一推測得到了實驗結(jié)果的支持，即串聯(lián)共培養(yǎng)的敏感性增加主要發(fā)生在較低濃度藥物中。

HUMIMIC應用案例-2：四器官串聯(lián)芯片（4-OC）

Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. 
2019, Future Science OA

在體內(nèi)，每個器官都保持著自己的獨立性，同時通過血液中的細胞和因子，與其他器官保持相互通訊。保持體外培養(yǎng)物的表型的同時，如何維持組織和器官間的通信一直是該領(lǐng)域的一個挑戰(zhàn)。所以，將幾種類器官串聯(lián)在一個共同的培養(yǎng)基的循環(huán)中，通過分泌的因子進行通訊和交流。模擬多器官之間的交流，可以研究每個器官代謝的產(chǎn)物對其他器官產(chǎn)生的影響，以及環(huán)境因子對于多器官的系統(tǒng)性效應。