PCR技術(shù)的定量原理:
擴(kuò)增曲線(xiàn)
在Real- qPCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線(xiàn),即為擴(kuò)增曲線(xiàn)。熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)一般分為基線(xiàn)期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。
在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化,此時(shí)即為基線(xiàn)期。
PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺(tái)期”。在該時(shí)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無(wú)線(xiàn)性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出初始模板量。
熒光染料的優(yōu)點(diǎn):
產(chǎn)品僅用于科研使用簡(jiǎn)便;
可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合;
價(jià)格便宜;
熒光染料的缺點(diǎn):
不能區(qū)分不同的雙鏈DNA
引物二聚體會(huì)影響檢測(cè)的敏感性
非特異性產(chǎn)物會(huì)影響結(jié)果的敏感性
引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問(wèn)題可以通過(guò)熔解曲線(xiàn) (Melting curve) 進(jìn)行識(shí)別,進(jìn)而通過(guò)PCR引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來(lái)說(shuō),SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)手段。
產(chǎn)品名稱(chēng) | |
英文名稱(chēng) | Leishmania siamensis |
貨號(hào) | YSP96879 |
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熒光探針:
Real-e qPCR中的熒光探針為T(mén)aqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí),引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。
當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí),Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來(lái),從而使其發(fā)出熒光。檢測(cè)到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。
TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問(wèn)題,反應(yīng)結(jié)束后無(wú)需通過(guò)熔解曲線(xiàn)檢測(cè),縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):
熒光背景低;
敏感性高;
雜交穩(wěn)定性高;
熒光光譜分辨率好;
特異性高。
TaqMan探針技術(shù)的缺點(diǎn):
成本高;
設(shè)計(jì)難度大;
只能用于檢測(cè)產(chǎn)物長(zhǎng)度低于150bp的反應(yīng)。
由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類(lèi)基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。
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熒光定量PCR原理:
產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱(chēng)TaqMan PCR,后來(lái)也叫Real-Time PCR,是美國(guó)PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)圖。
一般而言,熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。
特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
反-羥基環(huán)己烷羧酸(>95.0%(GC)(T))甲氧基異喹啉
2-[(甲氧基亞甲基)氨基]芴(>98.0%(T))甲氧基吲哚-2-羧酸
(三氟甲氧基)酸(含有數(shù)量不等的酸酐)-6-氨基喹啉
溴氟(>98.0%(GC))-6-甲氧基喹啉
2-氨基-5-硝基吡啶(>98.0%(T))-6-甲氧基喹啉-甲酸酯
2-氨基-硝基吡啶(>97.0%(T))喹啉
氨基-4'-硝基聯(lián)(>96.0%(T))羥基喹啉
2--硝基-N-(>98.0%(GC))基-甲基吡啶
N-(2,二基)-L-氨酸甲酯(>98.0%(HPLC))2-氟基溴
二甲氨基-4'-硝基聯(lián)(>98.0%(HPLC))氨基-溴喹啉
二甲基氨基-4'-硝基茋(>98.0%(HPLC)(T))溴吡唑并[1,5-A]吡啶
羥基-4'-硝基聯(lián)(>98.0%(GC))2,3,5-三-4,6-二氟吡啶
(S)-(-)-2-(α-甲基芐氨基)-5-硝基吡啶(>99.0%(T))4,6-二喹啉
甲氧基-4'-硝基聯(lián)(>98.0%(GC))4,6-二羥基喹啉
甲氧基-4'-硝基芪(>98.0%(GC))4,6-二溴喹啉
N-甲基-(>98.0%(GC))4,7-二喹啉
甲基-(>97.0%(GC))4,7-二羥基喹啉
5-硝基尿嘧啶(>99.0%(HPLC)(T))4,7-二溴喹啉
泰國(guó)利什曼原蟲(chóng)探針?lè)晒釶CR檢測(cè)試劑盒CD20樣蛋白抗體(造血干細(xì)胞4跨膜蛋白3)Mad1/FITC 熒光素標(biāo)記Mad1抗體IgG100 ul
細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶CABLES1抗體MAdCAM-1/FITC 熒光素標(biāo)記粘膜血管定居因子抗體IgG100 ul
細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白3抗體MAdCAM-1/Biotin 生物素標(biāo)記粘膜血管定居因子抗體IgG100 ul
卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白148抗體Mafa/FITC 熒光素標(biāo)記v-maf 肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A抗體()IgG100 ul
卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白153抗體MAFbx/Fbx32/Atrogin-1/FITC 熒光素標(biāo)記泛素蛋白連接酶抗體IgG100 ul
卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白160抗體MAG-a/L-MAG /FITC 熒光素標(biāo)記髓鞘相關(guān)糖蛋白-a抗體IgG100 ul
卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白22抗體MAG-a/b /FITC 熒光素標(biāo)記髓鞘相關(guān)糖蛋白a/b抗體IgG100 ul
卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白25抗體MAGE-1/HLA-A1 proin /FITC 熒光素標(biāo)記黑素瘤抗原-1抗體IgG100 ul
卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白28A抗體MAGE-A4/FITC 熒光素標(biāo)記黑色素瘤相關(guān)抗原4抗體IgG100 ul