PCR技術的定量原理:
擴增曲線
在Real- qPCR中,對整個PCR反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。
在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。
PCR反應過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。
熒光染料的優(yōu)點:
產(chǎn)品僅用于科研使用簡便;
可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合;
價格便宜;
熒光染料的缺點:
不能區(qū)分不同的雙鏈DNA
引物二聚體會影響檢測的敏感性
非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性
引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎也的Real-time qPCR實驗手段。
產(chǎn)品名稱 | |
英文名稱 | Hyostrongylus rubidus |
貨號 | YSP96850 |
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熒光探針:
Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。
正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。
當擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。
TaqMan探針技術解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。
TaqMan探針技術的優(yōu)點:
熒光背景低;
敏感性高;
雜交穩(wěn)定性高;
熒光光譜分辨率好;
特異性高。
TaqMan探針技術的缺點:
成本高;
設計難度大;
只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應。
由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。?
熒光定量PCR原理:
產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術。該技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應的進行,PCR反應產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。
一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。
特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
2-甲基-6-基吡啶(>98.0%(GC)(T))氟酮
2-(甲氧基基)吡啶(>95.0%(GC)(T))對氟甲酰
2-基吡啶(>98.0%(GC))6-氟煙酸
(2-吡啶基)甲(>95.0%(GC)(T))氟
1-基異喹啉(>98.0%(GC)(T))2-哌啶甲酸
2-[(三氟甲基)基]吡啶(>98.0%(GC)(T))2-溴-5-吡啶
7-溴-5--8-羥基喹啉(>98.0%(GC)(T))2-溴-6-甲氧基吡啶
5-溴-8-羥基喹啉(>96.0%(GC))氟
5--8-羥基喹啉(>98.0%(GC)(T))(N,N-二甲氨酰基)酸
5,7-二溴-8-羥基喹啉(>98.0%(T))2,二氟肼
5,7-二-8-羥基喹啉(>98.0%(GC)(T))-2-羥基吡啶
5,7-二-8-羥基喹啉(>98.0%(T))1-溴-4,4,三氟丁烷
5-氟-8-羥基喹啉(>99.0%(GC)(T))1-溴-三氟甲氧基
8-羥基-7-基喹啉(>98.0%(GC)(T))(*基硅基)酸酯
并[b]噻吩(>97.0%(GC))5-溴-氟吡啶
2-溴噻吩(>98.0%(GC))2-氟-6-甲基吡啶
2-溴-5-噻吩(>95.0%(GC))三酐
溴-2-噻吩(>95.0%(GC))醋酸甲脒
紅色豬圓線蟲探針法熒光PCR檢測試劑盒萊姆病螺旋體抗體IL-15R Alpha/FITC 熒光素標記白介素15受體α抗體IgG100 ul
成熟相關蛋白BOULE抗體IL-16/FITC 熒光素標記白細胞介素-16抗體IgG100 ul
伸長因子結(jié)合蛋白抗體IL-16/FITC 熒光素標記白介素16抗體IgG100 ul
特異性性蛋白Y2抗體IL-17/FITC 熒光素FITC標記白介素-17抗體IgG20 ul
癌易感基因2相關蛋白抗體IL-17B/FITC 熒光素標記白介素-17B抗體IgG100 ul
酸化癌易感基因1抗體IL-17/PE 熒光素PE標記白介素-17抗體IgG20 ul
酸化癌易感基因1抗體IL-17R/IL-17RA/CD217/FITC 熒光素標記白介素17受體抗體IgG1 Kit
酸化上皮鈣粘附分子抗體IL-17(Inrleukin-17)human/FITC 熒光素標記白介素-17抗體()IgG100 ul
酸化癌易感基因1抗體IL-17RC/IL-17RL/FITC 熒光素標記白介素17受體C抗體IgG100 ul