1、 牡蠣包拉米蟲感染PCR檢測試劑盒簡介 
貨號：HB-903 
包拉米蟲感染的病原主要指牡蠣包拉米蟲（Bonamia ostreae）和殺蠣包拉米蟲（Bonamia 
exitiosa）。包拉米蟲感染（Infection with Bonamia）是一種侵襲牡蠣血細胞的致死性傳染病。
殺蠣包拉米蟲分布在澳大利亞和新西蘭；牡蠣包拉米蟲分布在歐洲和美國的部分地區(qū)?；疾∧迪牭?br />鰓及外套膜有時褪色成黃色，并出現(xiàn)廣泛的損傷，導致牡蠣死亡。但大多數(shù)受感染的牡蠣外表正常。
為適應(yīng)軟體動物的牡蠣包拉米蟲寄生蟲快速檢測和監(jiān)測的需要，本公司參照OIE發(fā)布的水生動物
疾病診斷手冊2.4.03章中推薦的PCR引物序列和檢測方法，同時也符合SN/T2434-2010《貝類包拉米
蟲檢疫技術(shù)規(guī)范》的PCR引物序列和檢測方法。經(jīng)多次實驗及系統(tǒng)優(yōu)化，開發(fā)了本試劑盒。應(yīng)用
本試劑盒進行核酸提前和PCR檢測具有快速、靈敏、特異、準確 、安全、操作簡單、應(yīng)用廣泛等特
點及優(yōu)點。
2、 試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴增試劑，具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積 
核酸提取試劑： 樣品 DNA 提取液 1
 樣品 DNA 提取液 2
 5ml×1 管
500µl×1 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
牡蠣包拉米蟲 PCR 反應(yīng)液
Taq 酶(5U/ul)
陰性對照
牡蠣包拉米蟲 陽性對照
 5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
 1ml×1 管
 1ml×1 管
*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。 
3、 樣本采集，存放及運輸 
3.1 樣本采集 
將新鮮牡蠣的消化腺上皮、腮、觸須等組織25 mg置于冰冷的鹽水中反復沖洗，濾紙吸干
表面水分后稱量（根據(jù)需要），置于勻漿研磨器中并加入冷的鹽水，進行手工勻漿研磨。注意
整個過程在冰上完成。
3.2 存放 
研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；-70 ℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復凍融（zui多凍融 3 次）。
3.3 運輸 
采用泡沫箱加冰密封進行運輸。 
4、 檢測步驟 
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進行)： 
4.1.1 取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和，對每個管進行
編號標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl，一份樣本換用一個吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min。
4.1.3 牡蠣包拉米蟲感染PCR檢測試劑盒盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃
條件下，2 000 r/min 離心 10 s。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清，
即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。
4.2 PCR 檢測 
4.2.1 擴增試劑準備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行）：
從試劑盒中取出 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應(yīng)體系配制見下表
2。
表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
4.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進行）：
向每個PCR管中各分裝15μL的混合液，再分別加入樣本DNA模板10μL，蓋緊管蓋，500 r/min
離心 30 s。
4.2.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進行）：
循環(huán)條件設(shè)置：
*階段，94℃/5 min（預變性）；
第二階段，94℃/1 min 變性，55℃/1 min 退火，72℃/1 min 延伸，30 個循環(huán)；
第三階段，72℃延伸 10min，4 ℃保溫。
4.3 瓊脂糖電泳 
用電泳緩沖液制備 1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好沒過膠
面，向 PCR 擴增產(chǎn)物中加入 1/6 體積的電泳上樣緩沖液（6X 上樣緩沖液），按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設(shè)立 DNA DL2000 Marker 做對照。5 V/cm 電泳約 0.5 h，當溴酚藍到達一定位置時停
止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增出預期的特異性 DNA 電泳帶，拍攝并記
錄。
5、 結(jié)果判定 
5.1 質(zhì)量控制 
PCR 后，陽性對照會出現(xiàn)一條 300 bp 的 DNA 片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。
5.2 擴增產(chǎn)物 
待測樣品 PCR 擴增后能在相應(yīng) 300 bp DNA 位置上有帶，可判為牡蠣包拉米蟲核酸陽性。確診前
需進行 PCR 產(chǎn)物測序。
6、 相關(guān)技術(shù)信息 
6.1 牡蠣包拉米蟲感染PCR檢測試劑盒引物序列 
F: 5’-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3’ 
R: 5’-CTG-ATC-GTC-TTC-GATCCC-CC-3’