愛爾蘭淀粉總量檢測(cè)試劑盒 庫(kù)存號(hào)：D408995

愛爾蘭淀粉總量檢測(cè)試劑盒 庫(kù)存號(hào)：D408995

愛爾蘭淀粉總量檢測(cè)試劑盒 型號(hào):k-tsta-100a庫(kù)號(hào)：D408995

淀粉總量檢測(cè)試劑盒

(α- /淀粉葡萄糖苷酶)

說明書

K-TSTA-100A

02/22

100 個(gè)測(cè)試/盒

AOAC Method 996.11

AACC Method 76-13.01

(and improvements)

引言

淀粉大致包含兩種成分，直鏈淀粉主要是通過α-1,4-糖苷鍵連接的 D-葡聚糖，

含有極少的 α-1,6 支鏈；而支鏈淀粉中葡萄糖分子之間除了以 α-1,4-糖苷鍵相連

外，還有以 α-1,6-糖苷鍵相連的分支結(jié)構(gòu)。淀粉的酶解法主要是將淀粉置于高溫

下，通過耐熱α-進(jìn)行糊化，以產(chǎn)生一系列直鏈和支鏈糊精，隨后用淀粉葡

糖苷酶（AMG）定量水解為葡萄糖。在 ATP 和 NADP+ 存在下，使用葡萄糖氧

化酶/過氧化物酶 (GOPOD) 試劑或己糖激酶/磷酸葡萄糖脫氫酶檢測(cè)釋放的葡

萄糖。在一系列成功研究的基礎(chǔ)上，該方法被采用為 AOAC 方法 996.11、AACC

方法 76-13.01 和 ICC 方法 168。

本試劑盒在 AOAC 方法 996.11 的基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)?shù)幕?，從而提供了一個(gè)

加方便用戶的淀粉檢測(cè)方法，即快速總淀粉檢測(cè)法(RTS)(圖 1)[程序(a)]。

圖 1 快速總淀粉檢測(cè)法(RTS) [程序(a)]

本試劑盒可用來檢測(cè)各種食品、飼料、植物和谷物產(chǎn)品（天然或加工）中的總淀

粉含量。對(duì)于大多數(shù)樣品（例如小麥粉），在耐熱 α-存在的情況下，淀粉

能在約 100 ℃的孵育過程中溶解。含有高水平抗性淀粉（例如高直鏈玉米淀

粉）的樣品則需要在 1.7 M 的冷 NaOH 或熱的 DMSO 中預(yù)溶解。對(duì)于僅含有可

溶性淀粉或麥芽糊精的樣品，不需要用耐熱α-進(jìn)行孵育。

反應(yīng)原理

耐熱 α-將淀粉水解成可溶性的帶支鏈/不帶支鏈的麥芽糖糊精 (1)。

必要時(shí)，可通過用冷的 1.7 M NaOH 攪拌來預(yù)溶解樣品中的抗性淀粉，然后用乙

酸鈉緩沖液中和，用 α-水解(2)。

另外，在 100°C 的 DMSO 中進(jìn)行溶解也是的方法。

淀粉葡萄糖苷酶 (AMG) 可將麥芽糊精定量水解為 D-葡萄糖 (3)。

D -葡萄糖氧化為 D -葡萄糖酸，釋放等摩爾量的過氧化氫(H2O2)，該反應(yīng)在含過

氧化物酶和醌亞胺染料的比色反應(yīng)中可定量檢測(cè)（4, 5）。

單個(gè)樣品的分析可以在 70 分鐘內(nèi)完成，20 個(gè)樣品可以在 2 小時(shí)內(nèi)完成。

特異性、靈敏度、線性和度

該試劑盒對(duì) α-葡聚糖（包括淀粉、糖原、植物糖原和非抗性麥芽糊精）具有特異

性。

該試劑盒的小吸光度差異為 0.010 單位。 根據(jù)推薦的總淀粉 (RTS) 方法，使

用 100 mg 的樣品重量和 10.2 mL 的提取體積，這相當(dāng)于約 0.09 g/100 g 的總

淀粉含量。檢出限為 0.18 g/100 g 總淀粉，即樣品質(zhì)量為 100 mg，提取體積為

10.2 mL 時(shí)，吸光度差異為 0.020。該方法在每次檢測(cè) 4-100 μg D -葡萄糖范圍內(nèi)

時(shí)呈線性關(guān)系。

干擾

如果 D-葡萄糖的轉(zhuǎn)化在測(cè)試規(guī)定的時(shí)間內(nèi)（約 20 分鐘）完成，一般可以認(rèn)為

沒有發(fā)生干擾。

試劑盒

Megazyme 提供對(duì)總淀粉含量進(jìn)行 50/100 次檢測(cè)的試劑盒。該試劑盒包含完整

的檢測(cè)方法以及：

瓶 1：耐熱 α-（Megazyme 貨號(hào)：E-BSTAA。pH 6.5，40°C，3,000 U/mL；

pH 5.0，40°C，3,000 U/mL），在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 4 年以上，在-10°C 下可穩(wěn)定

保存 10 年以上。

K-TSTA-50A: 5 mL

K-TSTA-100A: 10 mL

瓶 2：淀粉葡萄糖苷酶（Megazyme 貨號(hào)：E-AMGDF。pH 4.5，40°C 時(shí)，底物為

可溶性，酶活為3300 U/mL；底物為對(duì)硝基苯-β-麥芽糖苷，酶活為200 U/mL），

在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 4 年以上，在-10°C 下可穩(wěn)定保存 10 年以上。

K-TSTA-50A: 5 mL

K-TSTA-100A: 10 mL

瓶 3：GOPOD 試劑緩沖液。緩沖液（50 mL，pH 7.4），含對(duì)羥基和

鈉（0.09% w/v）。在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 4 年以上。

瓶 4：GOPOD 試劑酶。含葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和 4-氨基。凍干

粉。在-10°C 下可穩(wěn)定保存 4 年以上。

瓶 5：D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mL，1.0 mg/mL），溶劑為 0.2% (w/v) 。室溫

保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。

瓶 6：標(biāo)準(zhǔn)化常規(guī)玉米淀粉質(zhì)控樣。小瓶標(biāo)簽上顯示的是淀粉含量。室溫保存，

可穩(wěn)定保存 5 年以上。

A. 試劑/懸液的制備：

1. 使用提供的瓶 1 中的內(nèi)容物。該溶液是粘性的，因此應(yīng)該用容積式分配器進(jìn)

行操作，例如 搭配 5.0 mL 吸頭 BRAND PD-Tip®使用的 BRAND HandyStep® S

（用于移取 0.1 mL 的試樣）。

在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 4 年以上。

在-10°C 下可穩(wěn)定保存 10 年以上。

注：如果使用者參考 AOAC 方法 996.11（方法 c），請(qǐng)用含 5 mM 氯化鈣的

MOPS 緩沖液（50 mM，pH 7.0）[B(e)]將瓶 1 的內(nèi)容物稀釋 30 倍后再使用。

2. 使用提供的瓶 2 中的內(nèi)容物。該溶液是粘性的，因此應(yīng)該用容積式分配器進(jìn)

行操作，例如 搭配 5.0 mL 吸頭 BRAND PD-Tip®使用的 BRAND HandyStep® S

（用于移取 0.1 mL 的試樣）。

在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 4 年以上。

在-10°C 下可穩(wěn)定保存 10 年以上。

3. 將瓶 3（GOPOD 試劑緩沖液）用去離子水定容至 1L，配制完成后立即使用。

注：（1）儲(chǔ)存時(shí)，濃縮緩沖液中可能會(huì)形成鹽晶體。當(dāng)該緩沖液用去離子水稀釋至 1L

時(shí)，它們?nèi)芙狻?/p>

（2）該緩沖液含有 0.09% (w/v) 。這是一種有毒化學(xué)品，配制時(shí)請(qǐng)做好防

護(hù)。

4. 先將瓶 4 中的內(nèi)容物溶于 20mL 的溶液 3 中，再將其和剩余的溶液 3 混勻。

用鋁箔紙將試劑瓶包裹以避光放置。此試劑稱之為為葡萄糖測(cè)定試劑(GOPOD

Reagent)。在 2-5°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存約 3 個(gè)月。在-10°C 下可穩(wěn)定保存 12 個(gè)月以上。

注：（1）如果該試劑以冷凍狀態(tài)儲(chǔ)存，好將其分裝為約 200 mL 的等分試樣，在使用

過程中僅冷凍/解凍一次。

（2）新配制的試劑可能呈淡黃色或淡粉色。在 4°C 儲(chǔ)存的 2-3 個(gè)月內(nèi)，溶液顏色會(huì)逐

漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。以去離子水為背景時(shí)，該溶液的吸光度應(yīng)小于 0.05。

5＆6. 瓶 5、瓶 6 中的內(nèi)容物可直接使用。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。

B. 試劑配制（本試劑盒不提供）

試劑 1 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液 (100mM，pH 5.0)

將 5.8mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 900mL 蒸餾水中。通過添加 1M (4g/100mL)

溶液（需要大約 30mL）將 pH 值調(diào)節(jié)至 5.0。加入 0.74g 二水氯化鈣并

溶解。定容至 1L，將該緩沖液儲(chǔ)存于 4°C，在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 6 個(gè)月以上。

試劑 2 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液 (200mM，pH 4.5)

將 11.6mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 900mL 蒸餾水中。通過添加 1M (4g/100mL)

溶液（需要大約 60mL）將 pH 值調(diào)節(jié)至 4.5。加入 0.74g 二水氯化鈣并

溶解。定容至 1L，將該緩沖液儲(chǔ)存于 4°C，在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 6 個(gè)月以上。

試劑 3 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液 (600mM，pH 3.8)

將 69.6mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 1600mL 蒸餾水中。通過添加 4M

（16g/100mL)溶液將 pH 值調(diào)節(jié)至 3.8。加入 1.48g 二水氯化鈣并溶解。

定容至 2L。該緩沖液可在室溫下穩(wěn)定儲(chǔ)存 12 個(gè)月以上。

試劑 4 NaOH 溶液 (1.7M)

將 68g NaOH 添加到 900mL 去離子水中并攪拌溶解，定容至 1L。儲(chǔ)存在密封容

器中。在室溫下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 2 年以上。

試劑 5 含氯化鈣（5mM）和（0.02%w/v）的 MOPS 緩沖液 (50mM，

pH 7.0)

可選：僅當(dāng)使用程序 (c) 和 (d) 分析樣品時(shí)才需要。

將 11.55g MOPS（鈉鹽，Sigma 目錄號(hào) M9381）溶解在 900mL 蒸餾水中，通過

添加 1M (10%v/v) HCl（需要約 17mL）將 pH 值調(diào)節(jié)至 7.0。加入 0.74 克二水氯

化鈣和 0.2 克并溶解。定容至 1L。將該緩沖液儲(chǔ)存于 4°C，在 4°C 下可

穩(wěn)定儲(chǔ)存 6 個(gè)月以上。

注意:待 pH 值調(diào)整完成后再加。酸化時(shí)會(huì)釋放出有毒氣體。

試劑 6 乙醇（50%和 80% v/v）

50%v/v：將 500mL 乙醇(95%v/v)添加到 500mL 蒸餾水中。

80%v/v：將 800mL 乙醇(95%v/v)添加到 200mL 蒸餾水中。

將各試劑儲(chǔ)存在 1L 試劑瓶中。在室溫下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 4 年以上。

C. 需要的設(shè)備

1. 研磨機(jī)

2. 離心機(jī)（4000rpm）

3. 微量離心管（13000rpm）

4. 分光光度計(jì)，能夠在 510 nm（10 mm 路徑長(zhǎng)度）下運(yùn)行

5. 分析天平

6. 恒溫水浴鍋（50℃）

7. 沸水浴鍋（配有試管架）

8. 磁力攪拌器

9. 渦旋攪拌器

10. 移液器/移液槍

11. 容積式移液器（如 Brand HandyStep® S）

12. 一次性離心管（13mL, 101×16.5mm）

13. 一次性微量離心管（2.0mL）

14. 玻璃試管（14mL, 16×100mm）

15. 康寧培養(yǎng)管（16 x 120 mm, 帶螺帽）

16. 塑料“午餐盒”（足夠容納試管架，作冰水浴用）

D. 控制和預(yù)防措施

a. 與 GOPOD 試劑進(jìn)行孵育的時(shí)間并不重要，但應(yīng)至少為 20 分鐘，并在顯色反

應(yīng) 60 分鐘內(nèi)進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

b. 每組檢測(cè)都應(yīng)包括空白試劑和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照（100 μg，一式四份）。葡萄

糖-GOPOD 的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)具有線性。

i)空白試劑：0.1 mL 蒸餾水+ 3.0 mL GOPOD 試劑。

ii)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：0.1 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 (100 μg/0.1 mL) +3.0 mL GOPOD 試

劑。系數(shù)因子“F”（第 15 和 16 頁）的計(jì)算方法是將分析的 D-葡萄糖質(zhì)量（100

μg）除以其在檢測(cè)中得到的吸光度結(jié)果（例如 100/1.038 = 96.386）。每次檢測(cè)所

得到的吸光度值可能會(huì)有所不同。

c. 對(duì)于每一次檢測(cè)，都應(yīng)包括標(biāo)準(zhǔn)面粉或淀粉樣品。

d. 對(duì)于每新批次的 GOPOD 試劑，每 100 μg 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)時(shí)所需

時(shí)間大約為 15 分鐘（通過顯色效果來判斷反應(yīng)是否到達(dá)終點(diǎn)）。

加包裝3KG